电子鼻联合化学计量学鉴别沉香精油的不同产地及提取方式

沉香为瑞香科植物白木香Aquilaria sinensis (Lour.) Gilg含有树脂的木材[1],是中国、日本、印度及东南亚等多地沿用已久的传统名贵香料与药材。早在南北朝时,陶弘景在《名医别录》中已将其列为上品[2],彰显其自古享有的“香中之王”盛誉,《新修本草》中也详细记载了沉香的产地、性味、功效主治[3]。沉香气味芳香,性微温,味辛、苦,归脾、胃、肾经,功能行气止痛、温中止呕、纳气平喘,临床常用于胸腹胀闷疼痛、胃寒呕吐呃逆、肾虚气逆喘急等症[1]。现代研究表明,挥发油是沉香发挥药效的关键部位之一,其主要包含芳香族、倍半萜及色酮类成分,具有抗抑郁、镇静催眠、改善脑卒中以及调节心脑血管和消化功能等多种药理活性[4-8],展现出极高的药用价值与在医药、食品及化妆品领域的广阔应用前景。沉香精油(AquilariaeLignumResinatumessential oil,AEO)的成分特征深受其地理来源与提取工艺的影响。

然而,将电子鼻技术系统性地应用于区分沉香精油的地理来源与提取方式的研究仍待深入。尽管电子鼻能够快速获取样品的整体气味信息,但仅凭其响应值难以直接阐明导致分类差异的具体化学成分,无法建立“气味-成分”之间的内在关联[30]。因此,集成电子鼻的快速判别优势与GC-MS的精准成分分析能力,并结合化学计量学进行多维数据解析,有望构建一种更为完善的沉香精油分类与溯源新策略。基于此,本研究收集了来自7个不同产地、2种主要提取方式[水蒸气蒸馏法(steam distillation extraction,SDE)与超临界流体萃取法(supercritical fluid extraction,SFE)]的38批沉香精油样品,联合运用电子鼻与GC-MS技术,并结合PCA、PLS-DA及OPLS-DA等化学计量学方法,旨在探究不同产地与提取方式沉香精油的气味与化学成分差异,筛选并鉴定导致其差异的关键挥发性成分,为沉香精油的分类与溯源提供一种基于化学成分特征的快速分析新方法。

1 仪器与材料

1.1仪器

7890A/5975C型气相色谱-质谱联用仪,美国安捷伦科技有限公司;BSA224S-CW型电子天平,赛多利斯科学仪器(北京)有限公司;Super Nose型电子鼻,上海瑞玢智能科技有限公司。

1.2样品

本研究共收集38批沉香精油样品,详细信息见表1。样品涵盖中国海南、中国广东、中国广西、中国香港、柬埔寨、老挝和泰国共7个产地,提取方式包括SDE与SFE。所有样品购自市场后,均于4 ℃条件下避光保存,并依次编号为S1～S38。

2 方法和结果

2.1 基于GC-MS技术的沉香精油样品中挥发性成分分析

2.1.1 GC-MS检测取各沉香精油样品各100 μL,分别放入10 mL量瓶中,加无水乙醇溶解,无水硫酸钠脱水,采用0.22 μm的微孔滤膜滤过,续滤液即为待测样品。

采用GC-MS法对其进行成分检测,GC条件:采用Agilent HP-5MS(30 m×250 µm,0.25 µm)毛细管色谱柱,以高纯度He(99.999%)为载气,进样量1 µL,分流比10∶1,体积流量1 mL/min,升温程序:初始温度为60 ℃,保持2 min,以10 ℃/min升至140 ℃,再以1 ℃/min升至180 ℃,保持2 min,最后以20 ℃/min升至300 ℃,保持10 min。MS条件:EI离子源,电子能量70 eV,离子源温度230 ℃,质谱四极杆温度150 ℃,界面温度250 ℃,溶剂延迟3 minm/z30～650。

2.1.2 挥发性成分分析取沉香精油样品,按照“2.1.1”项下条件检测,并采用NIST 17.0质谱数据库鉴定化学成分。结果表明,不同产地、提取方式的样品化学成分具有很大差异,38个沉香精油样品主要共有成分为苄基丙酮、沉香螺醇、去氢呋喃酮和2-(2-苯乙基)色酮,其他各个成分在不同的产地中均体现了明显的差异性。38个沉香精油样品中所有已鉴定化合物的色谱图见图1,代表性产地、代表性提取方式的样品,GC-MS成分分析结果如表2、3所示。

2.1.3 基于挥发性成分的不同沉香精油样品的PLS-DA

(1)基于PLS-DA筛选不同产地沉香精油样品的差异挥发性化合物:由图2-A和表4可知,共筛选出11种VIP>1的标志性差异化合物,分别为2-(2-苯乙基)色酮、6-甲氧基-2-(2-苯乙基)色酮、3,5-二甲氧基-1,2-二氢萘、2-[(2S,4aR)-4a,8-二甲基-1,2,3,4, 4a,5,6,7-八氢萘-2-基]丙-2-醇、(2Z,6E)-3,7-二甲基-9-(1-甲基亚乙基)-2,6-环癸二烯-1-酮、6,7-二甲氧基-2-(2-苯乙基)色酮、沉香螺醇、2-(4-甲氧基苯乙基)色酮、(+)-γ-桉叶油醇、棕榈酸、去氢呋喃酮,表明这些化合物是不同产地的差异挥发性化合物。

(2)基于PLS-DA筛选不同提取方式沉香精油样品的差异挥发性化合物:为筛选2种提取方式沉香精油样品的差异挥发性化合物,对GC-MS技术检测到的成分峰数据进行PLS-DA,并通过变量重要性投影(variable importance projection,VIP)值,筛选出对样本分类贡献大的关键差异化合物(图2-B和表4)。VIP通过PLS-DA载荷图判别所得,VIP值越大,表明该因素对样本分类的贡献越大,通常VIP大于1的变量被认为是重要的区分变量。共筛选出10种VIP>1的标志性差异化合物,分别为2-(2-苯乙基)色酮、6-甲氧基-2-(2-苯乙基)色酮、去氢呋喃酮、白菖烯、6,7-二甲氧基-2-(2-苯乙基)色酮、(+)-γ-桉叶油醇、沉香螺醇、2-[(2S,4aR)-4a,8-二甲基-1,2,3,4,4a,5,6,7-八氢萘-2-基]丙-2-醇、3,5-二甲氧基-1,2-二氢萘、棕榈酸。其中绝大部分为芳香族化合物,少数为呋喃类、有机酸酯和萜类,说明这几类化合物是不同提取方式沉香精油的差异挥发性化合物。

结合图2和表4,不同产地及不同提取方式的沉香精油样本中,2-(2-苯乙基)色酮、6-甲氧基-2-(2-苯乙基)色酮2个色酮类成分,均为对分类结果影响最大的差异性化合物,说明色酮类化合物是影响沉香精油分类判定的核心标志成分。

2.2 电子鼻检测与数据分析

2.2.1电子鼻检测采用电子鼻仪器对沉香精油香气特征信息进行收集。取30 μL挥发油于进样瓶中,进气体积流量为0.6 L/min,每个样品分析采样时间为120 s,传感器自清洗时间为180 s,通过仪器的14个传感器(N1～N14)记录响应值数据,每个样品平行测定3份,电子鼻14个传感器的性能参数信息见表5。将原始数据导入Origin 85、SIMCA 14.1软件中采用Origin 85制作雷达图,对样品气味特征进行综合评价,采用SIMCA 14.1软件进行PCA及OPLS-DA。

2.2.2电子鼻传感器响应值数据分析沉香精油含有多种化学成分,不同成分经电子鼻传感器检测所得的响应值都显示出自己的特征,电子鼻14个传感器的响应值可以归属于精油中不同成分的贡献,根据响应值进行分析,可将成分特征信息与其产地或提取方法进行关联。通过传感器数据建立气味信息雷达图,结果见图3,不同沉香精油样品的电子鼻响应值差异分析结果见表6。对不同沉香精油样品电子鼻差异传感器的响应值(表6)进行分析比较,发现不同提取方式和不同产地的差异传感器主要为N1和N8。SDE所得沉香精油样品在N1和N8传感器的响应值显著高于SFE样品(P<0.05);中国海南的沉香精油样品,在N1传感器的响应值显著高于中国广东、中国香港及东南亚的沉香精油样品,中国海南的沉香精油样品在N8传感器的响应值显著高于中国广东、中国香港。因此,初步推测芳香族类化合物、胺类化合物是区分不同提取方式和产地的主要化学成分。

2.3 不同沉香精油样品电子鼻数据的PCA

2.3.1 电子鼻传感器响应值数据PCA方法采用SIMCA 14.1软件对其中36个沉香精油样本(预留不同提取方式、不同产地的2个样本做模型预测用于验证)电子鼻传感器响应值数据进行PCA,以分析样本在整个响应面中的分布。采用散点图来表示原始变量的线性组合,在响应面中,2个样本拟合得越紧密,个体之间的差异就越小,反之,表示个体之间差异越大。

2.3.2 沉香精油样本散点分布36个沉香精油样品电子鼻数据PCA的散点分布图见图4。分值最高的2个主成分得分对光谱信息的贡献率分别为48.9%、30.8%,前3个主成分的累积贡献率为82.7%。从不同提取方式的散点图可以观察到样本明显被区分为2个聚类,沿着X轴方向,在PC1的散点图上,提取方式为SDE的沉香精油样品聚集在正侧,而SFE的沉香精油样本聚集在负侧,散点图中出现的这种聚类是基于与沉香精油样品中存在的化学成分组成相关的电子鼻响应值特性的差异。此外,S24是一个特殊样本,它是由SDE和SFE 2种方式混合提取而得,从PCA结果来看,它明显偏离这2个核心区域。从不同产地的散点图可以观察到,沿X轴方向,在PC1的散点图上,大多数来自中国广东的沉香精油聚集在正侧,来自中国海南的沉香精油样本聚集在负侧。沿X轴在PC1的散点图上,老挝和印度尼西亚等东南亚国家的沉香精油样本主要聚集在正侧,而中国广西的样本集中在中心区域。综上,PCA在区分提取方式上效果显著,但在区分地理来源时存在重叠,例如来自中国广西、中国香港产地的样品与东南亚样品较为相近,这可能与样品间化学成分相似性较高有关,也可能是由于该产地样本数量较少所导致。因此,考虑进一步采用OPLS-DA可有效消除无关变量干扰,提升分类精度。

2.4 不同沉香精油样品电子鼻数据的OPLS-DA

2.4.1 电子鼻传感器响应值数据OPLS-DA方法使用SIMCA 14.1软件,将收集的38个沉香精油随机分为校准数据子集和验证数据子集,将电子鼻响应值数据用于建立OPLS-DA模型,并进行模型预测与验证。其中36个样本在建模时按已知的信息被分配为不同提取方法和不同产地,对样本的产地和提取方法进行聚类分析;将随机选取的不同提取方式、不同产地的2个电子鼻样品数据(S21和S28)作为未知样本,不设置分组类别,计算预测值并与实际值进行比较,评估判别模型的准确性。

2.4.3 不同提取方式沉香精油样品OPLS-DA分类判别模型的建立在不同提取方法的判别模型中,以SDE、SFE、SFE+SDE 3种提取方式对36个沉香精油样本数据进行分类。得分散点图如图6-A所示,从得分图可知,所有沉香精油样本呈现出明显的聚类趋势,3种提取方式区分明显,其RX2=0.790,RY2=0.647,Q2=0.633>0.500,模型解释度和预测能力均良好。特别的是,其中有1个沉香精油样本是SDE与SFE混合提取所得的样本,在得分图中,可以看到该样本(S24)明显与其他2种提取方式区分开来,且处在2大类的中间位置,说明模型对于样本提取方式的判断较为准确,能够对不同提取方法的样本做出良好的判断。如图6-B所示,200次置换检验模型验证R2=−0.027 9,Q2=−0.274 0,Q2点的回归线与纵轴相交于原点以下,模型具有有效性;根据VIP图并结合载荷图离子加载值越大组间分离程度越强的特点,筛选出区分3组提取方式的3种传感器,影响显著性排序为N8>N1>N4,如图6-C、D所示。